精准医学的新领域：卵巢癌单细胞测序研究
卵巢癌是以组织细胞存在异质性为特征的疾病，由多种分子和环境因素共同引起，例如肿瘤内细胞团进化，细胞可塑性和多种随机因素导致的变异。导致肿瘤组织内异质性发生的染色体不稳定与患者预后不良有关，并且携带大量亚克隆突变的患者复发的机率更高。癌症治疗中的一个关键挑战是检测可能具有耐药性的稀有细胞亚群。高分辨率微阵列和下一代测序技术的快速发展，增加了我们对上皮性卵巢癌标志分子的了解。但是，绝大多数研究都是针对包含数千到数百万个细胞的大量样品进行的分析，所得结果数据为这些细胞指证的平均值。单细胞测序技术提供了对大量单个癌细胞进行高分辨率分子表型鉴定的方法，并能够表征卵巢癌患者的肿瘤内异质性。
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为什么要开展卵巢癌单细胞测序
每个细胞都具有独特的转录组、表观基因组和局部微环境。即使是基因相同的细胞，在驱动和调节转录和翻译的机制中也会经历随机波动，从而导致基因“随机性“表达。这种潜在的细胞异质群体在卵巢癌中很明显。单细胞测序分析能够在转录组水平上，对每个细胞进行研究。传统的RNA测序（RNA-Seq）方法分析了癌组织中数千个细胞的总RNA分子水平。这一研究技术所丢失的信息包括：肿瘤内部存在哪些类型的细胞，它们具有哪些结构特性（例如突变）以及它们在癌组织内部有哪些功能（例如基因表达或蛋白质丰度/功能）以及它们与宿主之间的相互作用（例如宿主免疫系统）。单细胞RNA测序技术（scRNA-Seq）已成为将肿瘤组织分类为各种细胞类型和/或细胞生理状态的强大研究技术，能够对肿瘤样本中成千上万个细胞进行逐细胞分子和细胞表征分析，从而能够提供癌症耐药（铂等）机制的新见解，并有可能发现新的治疗靶标。
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单细胞RNA测序程序
scRNA-seq基本步骤：病人组织样本获取；制备单细胞悬浮液；细胞裂解；mRNA捕获及反转录为cDNA；cDNAPCR扩增；扩增子测序；测序数据生物信息学分析。基于这些基本步骤的不同技术方案已经被开发出来。试验方案的一般原则：样本获取和制备单细胞之间的时间间隔应该尽可能缩短以避免细胞死亡。
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样本获取
在临床外科手术过程中，经过临床病理检查之后，便可以从新鲜的病理组织获取样本或者从需切除遗弃的病理组织获得。获取组织后，可以从多套酶消化protocols中选择，从而实现细胞悬浮液的制备。酶消化的持续时间、温度、酶用量会对单细胞基因表达终局产生影响。与对整个单细胞测序相比，对单核测序能够降低单细胞解离过程中人为因素造成的污染。
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单细胞分离
目前，成熟的单细胞分离的实验方案包括：
1.微流控技术分离单细胞。微流控技术培养细胞主要分为二维培养和三维培养两种方式。二维培养即细胞在芯片上贴壁生长，通过在芯片上流过培养基来提供营养物质，排出废物。3D培养即细胞培养在类似于细胞外基质的芯片环境中，可以尽可能地使细胞活动趋于体内真实状况。微流控技术可通过细微结构以及技术进行单细胞分离。
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2.连续稀释法分离单细胞。连续稀释法是将细胞群体放入合适的细胞悬液中，不断进行一系列不同梯度稀释，直至得到极少数量细胞甚至单细胞为止。
3.显微操作法分离单细胞。显微操作法依赖人工在高倍显微镜下观察细胞的的形态与颜色，利用显微操作进行挑选以分离出单个细胞。
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4.荧光激活细胞分选法分离单细胞。荧光激活细胞分选法是基于预先用荧光标记的细胞表面特异性分子标志或细胞光散射的特性，通过流式细胞仪分选出单个细胞或某些特殊细胞群的技术。
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5.激光捕获显微切割法分离单细胞。激光捕获纤维切割法是选择性利用激光在显微镜下从固定组织切片中进行显微切割和分离单细胞。
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单细胞RNA测序技术在卵巢癌中的应用
单细胞RNA测序技术已经应用于多种癌症问题的研究，比如癌症的发生、进化和治疗。单细胞RNA测序技术在黑色素瘤、乳腺癌和脑瘤研究领域已经取得诸多标志性研究成果。单细胞RNA测序技术在卵巢癌领域的研究正逐渐兴起，将会在如下几个方面为我们带来全新的认识：
1．表征肿瘤种群的异质性并鉴别细胞类型：
卵巢癌治疗失败和药物抵抗的主要原因在于肿瘤异质性。在正常细胞发生癌变的过程中，癌细胞累积突变并分化形成独特的细胞谱系和亚群。这种异质性可被认为是不同病患之间的变异性。在不同阶段、遗传病变或表达程序，异质性和不同的结果和治疗反应有关。
2.识别细胞亚型和分子亚型：
对高等级严重性卵巢癌样本单细胞RNA测序的研究发现，少数细胞能够表达与细胞干性相关的基因。已经有很多研究团队开始根据单细胞RNA测序结果对卵巢癌进行分类。同时，研究人员发现细胞分子亚型对于卵巢癌的诊治和发生发展预测具有重要价值。
3.卵巢癌干细胞、卵巢癌干细胞样细胞
有强力的证据表明，卵巢癌是受肿瘤干细胞驱使和维持的。这些细胞的分裂不活跃从而使他们能够很好的抵抗化疗药物。
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结语
单细胞测序技术发展十分迅速，而我们正站在这一技术发展的风口。毫无疑问，单细胞测序技术在精准医学领域的应用将会日益广泛，这也将会给我们提供了解肿瘤异质性、肿瘤耐药的发生、肿瘤转移的遗传驱动机制以及肿瘤进化。在单细胞水平对卵巢癌的认识将会指导新型治疗方案的研究与应用。
参考资料
[1]Winterhoff,Boris,etal.Single-cellsequencinginovariancancer:anewfrontierinprecisionmedicine.CurrentOpinioninObstetricsandGynecology31.1():49-55.
[2]李丽娟,etal.单细胞转录组测序技术原理及其应用.中国畜牧杂志55.2():15-21.
