Journalofneuro-oncology
Janaury29
IF:3.
（一）
Introduction
胶质母细胞瘤是一种毁灭性的原发性脑瘤。它本质上是异质的，有一个独特的起源细胞，这使得它的管理具有挑战性。替莫唑胺是治疗胶质母细胞瘤的标准化疗药物。然而，大多数胶质母细胞瘤患者在确诊后不到一年内就死于这种疾病，这是由于与癌症干细胞群体和肿瘤的局部弥漫性有关的化疗耐药性的结果。使这一挑战复杂化的是，真实概括体外GBM生物学相关方面的临床前模型仍未建立。肿瘤细胞，包括胶质母细胞瘤，传统上是在塑料基质上体外培养的，氧分压为20%。然而，体内GBM的氧分压在0.1%~10%之间。在体外研究GBM细胞时，许多研究没有考虑生理上相关的氧分压以及细胞外基质的变化，这些变化会影响细胞的增殖和运动等生物学特性。
现在需要3D培养，因为在2D单层中培养的细胞显示出异常的细胞间相互作用。因此，这种培养系统得出的大多数结论并不能准确地适用于体内的肿瘤。因此，3D体外培养系统提供了更真实的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，更具生理性，为2D系统提供了更好的选择。
最近，基于聚苯乙烯支架的三维模型被用于预测胶质母细胞瘤的药物-放射联合治疗。此外，胶质母细胞瘤肿瘤起始细胞已经成功地保持在微尺度的海藻酸盐水凝胶管(或AlgTube)中，这使得药物发现的成本可以负担得起。为了建立胶质母细胞瘤的三维体外培养系统，以便进行常规的药物试验和分子操作(如基因敲除)，在基于Cultrex的三维肿瘤生长试验(3D-TGA)中建立了胶质母细胞瘤细胞系，该方法允许提取单个细胞进行进一步培养。有了这个系统，也可以在低氧肿瘤微环境(TME)中培养细胞。比较2D和3D模型在描述形态学、胶质母细胞瘤干细胞标志物、代谢以及替莫唑胺化疗敏感性方面的差异。
综上所述，目前的结果提示微环境因素影响GBM细胞生物学。3D分析可以用来进一步表征GBM细胞，包括潜在的干细胞，以及肿瘤微环境影响其特征和数量的途径，包括它们的耐药性和侵袭/转移能力。
（二）
MaterialsandMethods
以3株GBM细胞(U87、U和SNB19)为研究对象，研究了Cultrex基底膜提取物(BME)[3D肿瘤生长试验(TGA)]培养细胞对细胞形态、基因表达、代谢和替莫唑胺耐药性的影响。
(三)
Results
1.在三维模型中培养的GBM是有活性的，可以再培养为2D单层或神经球
此前已经证明，3D模型可以培养胶质母细胞瘤细胞。为了了解三维培养的细胞是否可以传代培养，取U、U87和SNB19细胞分别培养在二维和三维模型中，并将其培养成神经球。人们注意到，从2D模型中只有U(图1A)和U87细胞形成神经球。从3D模型中收获后，U细胞形成了细胞和神经球的单层(图1A)。这些神经球可以维持到第六代以上(数据未显示)。值得注意的是，SNB19细胞在保持为2D单层后没有形成神经球(图1B)。然而，在3D模型中培养后，它们形成了神经球和单层细胞(图1B)，这表明在3D模型中培养可以影响干细胞群体形成神经球。尽管细胞在3D模型中首次培养时形成的神经球直径比在2D模型中首次培养时形成的神经球直径要小，但这并不显著(图1C)。
2.干细胞标志物CD和OCT4在2D、3D和Neurosphere检测中的表达
为了确定微环境对胶质母细胞瘤干细胞标志物表达的影响，我们检测了3D培养的细胞和从3D培养的2D(3D到2D)和神经球(3D到Neurosphere)培养的细胞中CD和OCT4的mRNA表达(图1)。我们的结果表明，与2D和3D分析相比，Neurosphere实验中CD的表达更高，其中U和SNB19细胞中CD的表达显著上调(图2；表1)。令人惊讶的是，与2D或神经球培养的细胞相比，3D培养的细胞中OCT4mRNA的表达显著上调(图2；表1)。这一结果提示微环境在不同干细胞标志物的表达中起着重要作用。这也表明不同的培养条件可以调节胶质母细胞瘤干细胞群体的表达。
3.与2D培养的细胞相比，3D模型在常氧和低氧条件下的代谢模式有所不同
在确定GBM细胞在3D模型中可以存活并可以再培养后，了解3D模型中的培养对新陈代谢的影响是很重要的，因为新陈代谢会影响化疗敏感性。为实现这一目标，U和SNB19细胞分别在常氧和缺氧条件下进行2D和3D培养。用AlamarBlue实验观察到2D和3D模型中的代谢模式是显著的。在2D模型中2天后，读出的代谢活性稳定(图3a-c)，并在低氧培养的SNB19细胞中逐渐下降(图3D)。然而，在3D模型中，观察到代谢读数减少，并逐渐增加(图3A-d)，在常氧培养的U细胞在第4天和第5天之间显示恒定的读数(图3A)。在U87细胞中，在2D实验中，代谢活性在第3天稳定下来，但在3D实验中从第3天开始逐渐增加。试图通过蛋白质印迹来理解蛋白质动力学在技术上是困难的，因为从3D基质中获取细胞需要时间。
4.3D赋予对替莫唑胺（TMZ）的抗性，该抗性在缺氧条件下得到增强
为了确定3D肿瘤微环境在对TMZ的抗性中的作用，在2D和3D分析中，在常氧和低氧条件下培养了GBM细胞（U87，U和SNB19）。我们发现，在正常氧和缺氧条件下，在3D分析法中培养的细胞对TMZ的抵抗力明显高于2D维持的细胞，在U细胞中则高达5倍（图4a和c）。为了进一步评估不同微环境在TMZ耐药性中的作用，使用U细胞作为模型，因为与U87相比，它们容易形成神经球，而当它们首次保持为2D时，SNB19细胞不形成神经球。两组U细胞暴露于低氧状态，第三组维持在常氧状态作为对照。保持常氧状态的集合以2D（单层）或神经球培养。缺氧24小时后，用替莫唑胺处理所有组的细胞。从最初暴露于缺氧的两组中，将一组立即转移到常氧（暴露于缺氧-Pre-H前24小时）（图4b）。替莫唑胺治疗72小时后，令人惊讶地发现，缺氧暴露对U细胞中替莫唑胺的耐药性没有任何显着变化（图4b）。另外，干细胞状况，即作为神经球培养的细胞，不影响细胞对替莫唑胺的抗性（图4b）。为了验证抗性的增加是3D环境的影响，首先将细胞培养为3D，然后在48h后从3D基质中收获细胞并培养为2D，然后用替莫唑胺处理，发现IC50值返回基线（未显示）。
（四）
Conclusions
综上所述，这些结果提示微环境因素影响基底膜对替莫唑胺的敏感性。了解3D模型中与替莫唑胺耐药有关的机制可能会导致新策略的确定，从而能够更有效地使用当前标准的护理制剂。
Reference：Anovel3Dinvitromodelofglioblastomarevealsresistance
totemozolomidewhichwaspotentiatedbyhypoxia.
PMID
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DOI:10./s---0
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