SciRep.
IF:4.（年）
Publishedonline：03June
Introduction
胶质母细胞瘤（GBM）仍然是具有挑战性的恶性肿瘤，越来越多的证据表明GBM也存在明显的免疫抑制作用。GBM患者已描述了几种抵御免疫机制：调节性T细胞增加，吲哚胺双加氧酶激活，抗原呈递失调以及STAT3驱动的髓样细胞抑制等。抑制性PD-L1的过表达是GBM细胞减毒T细胞的另一种机制，并且PD-1/PD-L1肽已获得FDA批准用于治疗许多癌症。在GBM中，PD-L1的表达是可变的，并且在没有明显浸润淋巴细胞的情况下发生，这表明它可能受肿瘤内在诱导而不是外在刺激的影响。目前已经发现多种机制可以驱动细胞内在的PD-L1诱导，包括PTEN丢失、异常信号转导、基因组扩增和翻译后修饰。
在CNS恶性肿瘤和其他癌症中，其他已知的PD-1配体PD-L2的表达仍未得到充分研究。在包括肾脏癌，乳腺癌，肺癌和胃肠道癌在内的多种恶性肿瘤中均观察到PD-L2表达。此外，在这些癌症中，PD-L2表达与较差的临床结果相关。
在本研究中作者对PD-L1和PD-L2在脑瘤细胞系中的表达进行了表征，以研究其表达调控的细胞内在机制，观察到PD-L1和PD-L2在脑肿瘤细胞系和患者来源的BTICs中高组成性表达，最终确定了PD-L1表达活跃的新型增强子区域和PD-L2表达活跃的新型调节区域。这两个区域都有GATA2的绑定位点，其表达是PD-L2上调的必要条件，也是PD-L1和PD-L2表达增加的充分条件。在本研究中，发现在低级别和高级别胶质瘤中，PD-L2表达增加与较差的临床结果相关。这些数据表明，PD-L2在脑瘤中表达，并与PD-L1一起部分受到GATA2转录活性的调控。
Results
作者从CCLE上下载数据，在52个神经胶质瘤细胞系中，有34个细胞的PD-L1mRNA表达高于CCLE平均水平，而22个细胞系的PD-L2mRNA表达高于CCLE平均水平（图1B）。
PD-L1和PD-L2的表达水平在一些细胞系中是一致的，而在另一些细胞系中则是不同的。为了证实CCLEPD-L1和PD-L2的表达，作者采用qRT-PCR方法在基因表达高或低的细胞系中评估基因表达水平。在6个细胞系中检测了高表达的PD-L1mRNA(图1C，上)，还发现包括GMS10，KALS1和AM38在内的细胞系中PD-L2mRNA高表达（图1C，底部）。通过流式细胞术评估PD-L1和PD-L2细胞表面表达水平，并与基因表达相一致。
接下来，作者通过qRT-PCR检测了从新诊断的GBM患者中建立的低传代(初始培养≤5传代)患者源性脑肿瘤起始细胞(BTIC)中PD-L1和PD-L2基因的表达。在5个TERT突变的BTIC细胞系中，4个表现出PD-L1和PD-L2基因表达，与高表达的良好传代细胞相似(图1E)。
这些数据表明，包括原发性BTIC的癌细胞系表现出PD-L1和PD-L2的高表达水平。
虽然PD-L1的抑制功能已经得到完善，但肿瘤细胞PD-L2过表达对T细胞功能的影响尚未得到很好的研究。在GL脑瘤模型中，GL衍生的突变型Imp3-D81N8-mer是一种免疫原性新抗原，作者检测了PD-L1和/或PD-L2过表达的影响。GL细胞表达低水平的PD-L1，而PD-L2没有表达或被诱导(图2A)。
为了检测两种PD-1配体对GL免疫原性的影响，作者分别过表达了PD-L1(GL.PD-L1)、PD-L2(GL.PD-L2)或两种配体(GL.PD-L1-L2)，并通过流式细胞术检测其单独过表达和联合过表达。与亲本GL相比，每种细胞系对Imp3新抗原特异性肿瘤浸润淋巴细胞的IFN-γ产生率均超过50％（图2C）。因此，肿瘤细胞过表达PD-L2会抑制类似PD-L1过表达的新抗原特异性T细胞功能，并与PD-L2在非肿瘤环境下的抑制功能相一致。
在确认人PD-L1和人PD-L2被IFN-γ上调后（图3A），作者验证了PD-L1和PD-L2在脑瘤细胞中的组成性表达至少部分是由CD和PDCD1LG2转录起始位点(TSS)附近顺式调控元件的转录活性引起的假设。通过整合UCSCGB和ENCODE数据集和CD，作者使用人类构建基因组参考序列联盟检测了3个候选调控元件与TSS相关
D-L1.Pr1（-至+），PD-L1.Pr2（+至+）和PD-L1.Pr3（+至+）（图3B）。后续实验证明了CD中的这几个顺式调控区可驱动转录活性。
为了确定在细胞系中观察到的组成性PD-L2表达的分子基础，作者采取了类似的方法来研究CD调控。在UCSCGB中整合ENCODE数据，作者确定了2个相邻但不同的候选调节区域，这些区域由H3K27Ac标志密度，DNase超敏性和TF结合位点定义，分别是PD-L2.Pr1（-至-），PD-L2.Pr2（-至+）（图3F）。Pr1区域对于PD-L2高表达细胞系的活性是必要的，后续实验表明PD-L2.Pr1包含驱动组成型转录活性的元件，并暗示GATA2/3有助于这种功能性作用。
用pBabe.GATA2或pBabe.puro逆转录病毒转导表达这些基础水平低的LN和LN细胞系，并检测PD-L1和PD-L2基因表达及表面蛋白水平。在这两种细胞系中，相对于阴性对照，qRT-PCR检测的PD-L1和PD-L2基因表达均在过表达GATA2后被显著诱导(图4A)。而且，与阴性对照相比（图4B，亮线），通过流式细胞术过表达GATA2的LN和LN细胞（图4B，暗线）上调了细胞表面PD-L1和PD-L2。
接下来研究了GATA2的表达是否需要调节PD-L1和PD-L2水平。尽管GATA2过表达足以上调PD-L1，但GATA2敲低并不足以降低PD-L1的细胞表面表达（数据未显示）。使用两种不同的shRNA构建的GATA2敲低导致IOMM-Lee(图4C)和AM38(图4D)中PD-L2基因表达下降和细胞表面表达下降。因此，增加GATA2的表达可能增加PD-L1和PD-L2的细胞表面水平，是构成性高表达PD-L2的必要条件。
因为发现PD-L1和PD-L2的表达水平在LGG和GBM中高度一致（Mantel-Haenszel卡方检验P0.），所以将PD-L1的表达水平纳入了分析。虽然个体PD-L1配体表达状态对GBM无病生存(DFS)没有显著影响(数据未显示)，但高PD-L2表达的GBM患者DFS较低表达患者有缩短趋势(图5A，左)(log-rank检验P=0.)。将GBM患者的DFS按PD-L1和/或PD-L2的表达水平分为3组，即均高表达，均低表达或仅一个高表达。具有PD-L1/PD-L2均高表达水平的GBM患者与具有均低表达水平的患者相比，DFS降低有统计学意义(均高与均低:HR,95%CI=1.95,1.21~3.15，对数秩检验P=0.)。但是在多变量Cox比例风险模型中，调整年龄、性别和IDH1状态后，PD-L1和PD-L2表达水平并不是单独与无病生存相关的(数据未显示)。
与低PD-L2表达水平的患者相比，高PD-L2水平的患者表现出显着缩短的总生存期（OS）和DFS（图5B）。具有高PD-L1和PD-L2表达水平的LGG患者与具有低表达一种或两种配体的患者相比，其OS和DFS具有统计学上的显着缩短（分别为图5C，左图和右图）。
在多变量分析中，即使在调整年龄、性别和IDH1状态后，高PD-L2水平仍独立与较差的DFS相关(HR,95%CI=2.98,1.36~6.50,p=0.，图5D，左)，尽管PD-L2水平对LGG患者的OS没有独立的统计学意义。最后，在多变量Cox比例风险模型中，经年龄、性别和IDH1状态调整后，高双表达的PD-L1/PD-L2与双低表达(p=0.)或高单表达的PD-L1或PD-L2(p=0.)相比，与较短的DFS独立相关(图5D，右)。因此，PD-L2的高表达与LGG的较差的临床预后相关，并且是LGG单独或与PD-L1较差的DFS的独立预后指标。
Conclusions
在本研究中，作者研究了免疫调节配体PD-L1和PD-L2细胞自主表达的分子基础。在CD和PDCD1LG2中鉴定了新的转录活性调控元件，发现GATA2直接调控PD-L1和PD-L2的表达。同时还观察到，高PD-L1和PD-L2表达与GBM和LGG较差的临床结果相关；高PD-L1/PD-L2水平在LGG中与较短的DFS独立相关。
END
Reference：GATA2RegulatesConstitutivePD-L1andPD-L2ExpressioninBrainTumors
PMID
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DOI:10./s---z
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